بررسی توزیع گونه های انتخابی باکتری ساکن در نواحی مختلف حفره دهان در کودکان caries free و severe-early childhood caries به روش real time pcr

پوسیدگی دندانی یکی از شایع ترین بیماریهای مزمن دوران کودکی محسوب می شود. علیرغم کاهش جهانی پوسیدگی در دندانهای شیری، پوسیدگی زودرس دوران کودکی هنوز هم یک مشکل حاد در کشورهای در حال رشد و بعضی کشورهای رشد یافته محسوب می شود. پوسیدگی دندانی علت چندگانه دارد که از جمله می توان به سبک زندگی و سابقه ژنتیکی فرد اشاره نمود. فاکتورهای میزبان شامل بزاق و خصوصیات سطحی دندان همگی در بروز پوسیدگی دخیل هستند(51). پوسیدگی دندانی نتیجه تقابل بین باکتری های اسیدوژن وتخمیر کربوهیدرات ها است.در حال حاضر مطالعات مولکولی و بررسی های کمّی بر روی اکوسیستم میکربی دهان مشخص نموده تجمع میکربی در حفره دهان پیچیده تر از آنچه است که قبلا تصور میشد(46). میکروارگانیسم اولیه پاتوژن مرتبط با پوسیدگی استرپتوکوک موتانس و سوبرینوس است (از دسته استرپتوکوکسی موتانس) و گونه های غیر استرپتوکوکی از جمله لاکتوباسیل، اکتینومیست ، بیفیدو باکتریا و ویونلا می باشد(45). پلاک دندانی به وسیله فعل و انفعالات باکتری ها با دندان آغاز شده و باکتری های موجود در بیوفیلم پلاک شدیداً توسط فاکتورهای خارجی که ممکن است با واسطه میزبان باشند، تحت تأثیر قرار می گیرند. در میزبان سالم، مقادیر کم پلاک باکتریائی به وسیله مکانیسم های دفاعی بدن، بدون تخریب مشخص کنترل می شوند. گونه های خاصی از انواع پاتوژن ممکن است نسبت به رده های دیگر، ویرولانس میکروبی بیشتری داشته باشند. افزایش تجمع پلاک نتیجه بهداشت نامطلوب دهان است. البته پاسخ میزبان به پلاک باکتریائی می تواند متفاوت باشد و تحت تأثیر خصوصیات ژنتیکی یا ژنوتیپ هر فرد، خصوصیات باکتری و عوامل محیطی قرار گیرد(52). استرپتوکوک موتانس پاتوژن اصلی پوسیدگی دندانی و بیماری های عفونی وابسته به بیوفیلم می باشد. این ارگانیسم ها در اجتماع پیچید? بیوفیلم دهان در حضور ساکارز، تحت ph پائین مسئول دمینرالیزه کردن دندان است(53). گونه های مختلف استرپتوکوک موتانس می توانند ویرولانس میکروبی متفاوتی داشته باشند و نشان داده شده که ژنوتیپ های مختلف آن، چسبندگی متفاوتی را نیز نشان می دهند. در افرادی با فعالیت پوسیدگی بیشتر، گونه های ژنوتیپ مختلف تأثیر سینرژیسم داشته، باند قویتری دارند و استعداد به پوسیدگی را بالا می برند(3). استرپتوکوک موتانس مهم ترین عامل در تکامل secc محسوب می شود. با این حال احتمالاً بیوفیلمی از گروه های باکتریائی مختلف ممکن است در بروز پوسیدگی دخیل باشند.بقای موجودات در محیط دهان به توانایی آنها در اتصال به سطوح بستگی دارد. تعداد اندکی از موجودات تخصص یافته و عمدتاً استرپتوکوکها، از قابلیت اتصال به سطوح دهانی از جمله مخاط و سطوح دندانی برخوردارند و لایه پلاکی که متشکل از استرپتوکوکها می باشد، فرصت اتصال سایر موجودات را فراهم می آورد. جمعیت استرپتوکوک موتانس بسیار متغیر است و در حالت طبیعی این موجودات درصد بسیار کمی از کل جمعیت پلاک را تشکیل می دهند، ولی می توانند تا حدود نیمی از کل استرپتوکوکهای دهان را تشکیل دهند. گرچه شواهد نشان می دهند که استرپتوکوک موتانس نقش مهمی در پوسیدگی ایفا می کند، ولی 700 گونه از باکتری در حفره دهان کلونیزه شده که در واقع اختلاطی از گونه های باکتری می تواند در تکامل پوسیدگی نقش داشته باشد(52). شناسائی استرپتوکوک موتانس توسط متدهای معمول مثل تست های سرولوژیک و بیوشیمیایی قابل انجام است. پلاک می تواند به عنوان منبعی حاوی استرپتوکوکهای موتانس برای روشهای تشخیص غیرتهاجمی جهت تشخیص و شناسائی انواع مختلف سروتیپ ها استفاده شود. در بین متدهای نمونه گیری بالاترین دقت تشخیصی از پلاک دندانی ذکر شده است. اگر چه در مطالعات اپیدمیولوژیک نمونه گیری از بزاق راحتتر است اما دقت تشخیصی در نمونه گیری از پلاک بالاتراز بزاق ذکر شده است( 54 ). شناسایی میکروارگانیسم ها توسط کشت میکروبی متداول و بررسی کلونی های آنان نیازمند وجود میکروارگانیسم زنده می باشد در حالیکه در روش pcr ، dnaاستخراج شده می تواند از میکروارگانیسم های زنده یا مرده صورت گیرد. در روش pcr نمونه ها راحت تر قابل انتقال و نگه داری برای مدت طولانی هستند. سالهاست که از روش pcr برای استخراج و جداسازی هر نوع ژنی از ارگانیسم های مختلف استفاده می شود و این تکنیک به روش معمول در آزمایشگاه به عنوان روشی سریع و متدی دقیق جهت شناسایی میکروارگانیسم ها تبدیل شده است(54). هر چند که استفاده از تکنیک pcr در شناسایی عوامل بیماری زای موجود در نمونه های بالینی بیماران ، در سراسر دنیا بسیار رایج و متداول است ، اما مطالعه تکنیک pcr در سال 1988 توجه همگان را به معایب موجود در این تکنیک معطوف نمود.در این مطالعه ، اولین نتیجه مثبت کاذب که در نتیجه آلودگی پرایمر های طراحی شده برای hbv با dna پلاسمیدی محتوی طول کامل ژنوم این ویروس بود رخ داده بود، ارائه شد(55). به دنبال این گزارش ، گزارشات متعدد دیگری در زمینه آلوده کننده های pcr و روش های پیشگیری از آن منتشر گردید. بر اساس نتایج مختلف مندرج شده از طریق مقالات میزان وقوع نتایج مثبت کاذب در pcr حدود 2 درصد می باشد و آنچه که به طور عمده سبب بروز این نتایج در pcr میشود عبارتند از، طراحی نامناسب پرایمر, عدم بهینه سازی آزمایش pcr ، ورود یک آلوده کننده اصلی به فرایند pcr از جمله محلول های واکنش و تجهیزات یا محیط آزمایش، انتقالdna هدف به تست مورد نظر از طریق آلودگی آن با نمونه دیگر، وجود مراحل پس از pcr در هنگام افزودن الگو و در نهایت نشت بین نمونه ها در ژل آگارز(56). هدف از مطالعه حاضربررسی توزیع گونه های انتخابی باکتری ساکن در نواحی مختلف حفره دهان در کودکان caries free و severe-early childhood caries به روش real time pcr بوده است. .به منظور بررسی میزان میکروارگانیسم ها ی پوسیدگی زاوارتباط آنها به صورت کمّی ، تحقیق حاضر با کاربرد روش مولکولی real time pcr که دقیق ترین و قابل اعتماد ترین روش برای تعیین غلظت ژنوم باکتری ها در نمونه های کلینیکی می باشدانجام گرفت .از این روش جهت تعیین کمّی و سریع گونه های پوسیدگی زا استفاده می شود.این متد مولکولی در تشخیص میکروب ها در بزاق و پلاک دندانی و لذا تعیین ریسک پوسیدگی بسیار مفید است.با کاربرد روش real time pcr محدوده وسیعی از سلول های باکتری ها قابل اندازه گیری می باشد(12(. مطالعه حاضر با استفاده از روش سایبرگرین طراحی و اجرا گردید. بر طبق مطالعات انجام شده این روش چندین مزیت قابل توجه دارد: 1.قابلیت اندازه گیری میزان محصول و تعیین بار باکتری. 2.مراحل تکثیر و شناسایی dna در یک مرحله انجام می شود و سیستم به صورت همگن است.این مساله نیاز به فرایند های بعد از pcr را برطرف می کند و در نتیجه احتمال وقوع نتایج مثبت کاذب کاهش می یابد. 3.زمان انجام آزمایش تا حد قابل توجهی کاهش می یابد(25 ،30). اگرچه هدف اصلی در این تحقیق ,بکار گیری تکنیکی نوین با قدرت جوابدهی سریع و دقیق در تشخیص 4 نوع باکتری دخیل در روند پوسیدگی در محیط دهان بوده است ، اما این ایده هم وجود داشت که بتوان در آینده از این روش برای تعیین بار باکتری در نمونه بیمار و پیگیری روند درمان استفاده کرد.. okada- ارتباط بین شیوع فرکانس استرپتوکک موتانس و پوسیدگی دندانی را با استفاده از روش pcr معمولی در کودکان ژاپنی نشان داده است(58). بر اساس مطالعه yano روش real-time pcr تکنیک تشخیصی مناسبی بخصوص برای میکروب های بی هوازی و ویروس هاست و از تکنیک های کشت میکروبی و pcr به مراتب دقیق تر است(33). seki و همکاران با استفاده از روش pcr شیوع موتانس و سوبرینوس را به صورت مختلط و به صورت انفرادی بررسی کردند. نتایج نشان داد آن دسته از کودکان که dmfs بالاتری داشتند آلودگی بیشتری به صورت مختلط داشتند (سروتیپ های متعدد) و آنهایی که آلودگی با موتانس و سوبرینوس داشتند پوسیدگی بیشتری را نسبت به گروهی که فقط با موتانس و یا فقط با سوبرینوس داشتند، نشان دادند(59). در مطالعه نیک و همکاران به بررسی حضور استرپتوکوکهای موتانس و سوبرینوس و سروتیپهای موتانس در دو گروه کودکان مبتلا به seccوcf با استفاده از تکنیک serotype-specific pcr پرداخته شده است .بر اساس نتایج این مطالعه درصد بالائی از افراد مورد مطالعه در هر دو گروه (83.3% secc ، 90% cf) آلودگی به استرپتوکوک موتانس را نشان دادند و بررسی توزیع سوبرینوس و موتانس بصورت توأم در مطالعه فعلی نشان می دهد، 7/27% از نمونه های گروه secc و 10% از نمونه های گروه cf آلوده به هر دو نوع میکروارگانیسم بودند که این در راستای مطالعات دیگر که حضور این دو میکروارگانیسم در پوسیدگی را تأیید می نماید، می باشد اما این تفاوت در مطالعه معنی دار نبود. این نتیجه می تواند پیشنهاد کنند? این مسئله باشدکه سایر گونه های اسیدوژنیک بجز موتانس و سوبرینوس ممکن است در تکامل پوسیدگی تأثیر گذار باشند و حضور این دو نوع باکتری به عنوان عامل قطعی در تکامل پوسیدگی نباید مد نظر باشند(60). choi و همکارانش به بررسی میزان استرپتوکوک موتانس در نمونه پلاک دندانی بوسیله روش qrt-pcr پرداختند تا ارتباط آن را با شیوع ecc در کودکان پیش دبستانی کره ای بسنجند. کودکان مبتلا به eccسطح بالاتری از استرپتوکوک موتانس را در پلاکشان نشان دادند(12). در مطالعه حاضر نیز مقادیر کمّی بالاتر غلظت ژنوم استرپتوکک موتانس در نمونه های پلاک دندانی در گروه secc در مقایسه با گروه cf در کودکان گروه سنی 5-3 سال مشاهده شد (p-value:0.02) . پلاک می تواند به عنوان منبعی حاوی استرپتوکوکهای موتانس برای روشهای تشخیص غیرتهاجمی جهت تشخیص و شناسائی انواع مختلف سروتیپ ها استفاده شود. در بین متدهای نمونه گیری بالاترین دقت تشخیصی از پلاک دندانی ذکر شده است. اگر چه در مطالعات اپیدمیولوژیک نمونه گیری از بزاق راحتتر است اما دقت تشخیصی در نمونه گیری از پلاک بالاتراز بزاق ذکر شده است(37). nakano معتقد است که دهان انسان شامل بیش از 500 گونه باکتری است که در حال تقابل با یکدیگر جهت کلونیزه شدن در بافت های دهان می باشند که نتیجه این تقابل پیچیده شکل گیری بیوفیلم میکروبی به عنوان پلاک دندانی ,پلاک زیر لثه ای و دبری های سطح زبان می باشد(39). بر اساس نتایج مطالعه mager باکتری های دهانی تمایل اختصاصی به سطوح مختلف بیولوژیک در حفره دهان از جمله دندان ها و مخاط دهان دارند .در مخاط دهان شاهد فرایند ریزش سلولی هستیم در حالی که درسطح نسج سخت دندان ریزش سلولی مطرح نیست ولذاتکامل بیوفیلم با تکامل و پیچیدگی بیشتر همراه است(17).این مسئله بر روی خصوصیات میکروبی این دو زیستگاه در محیط دهان اثرگذار می باشد.دندان ها، بافت نرم کراتینیزه و غیر کراتینیزه به ترتیب 50،30 و20% از وسعت دهان را شامل می شوند در حالیکه در)80% وسعت دهان (بافت نرم وضعیت میکربی هنوزکاملا مشخص نیست.نمو نه های پلاک دندانی و زبان نشان می دهد میزان میکروبهای پوسیدگی زا در پلاک دندانی بالاتر و ارزش تشخیصی بیشتری از زبان و گونه ها در تعیین پوسیدگی دارد(9). باکتری های دهانی در سطوح مختلف حفره دهان بر حسب اینکه رسپتور باکتری درکجا باشد به بافت می چسبند.بیش از 40 گونه باکتری در نواحی مختلف مخاط نرم، بزاق و پلاک مشاهده می شود. حتی مشاهده شده فلور میکروبی در سطح پشتی وطرفی زبان هم متفاوت هستند چون سطوح طرفی زبان غیر کراتینیزه و وسط آن کراتینیزه پاپیلاری و حاوی غدد ترشحی است(18). درمطالعه حاضر نمونه گیری مخاطی بصورت تجمعی (pool)از نواحی مختلف مخاط دهان صورت گرفته است.درنتایج حاصله بجز همبستگی بالای حضور استرپتوکوک موتانس درپلاک و مخاط افراد مبتلا بهsecc (r=0.755,p-value:0.001) وهمبستگی نسبی تجمع استرپتوکوک سانگوئیس در پلاک و مخاط افراد مبتلا به secc (r:0.492,p-value:0.028) در سایر موارد در گروه شاهد و مور،د تاییدی بر ارتباط تجمعی میکروارگانیسم های مورد مطالعه مشاهده نشد. مطالعه zongxin وهمکاران نشان داد تجمع فلور میکربی دربزاق و پلاک بصورت معنی داری از هم متفاوت است.وی عنوان نمود میکروبیوتای دهانی بسیار پیچیده تر از آنچه است که در گذشته تصور می شد(46). و همچنین zongxin نشان داد میزان فیلوتیپ های میکروبی بیش از 10000 در بالغین براساس تکنیک های مولکولی مشخص شده است و این نتیجه کاملا متفاوت از روش های مولکولی گذشته وکشت سنتی میکروارگانیسم می باشد(46). بر اساس مطالعات مولکولی جدید از جمله روشrealtime و microarray به راحتی نمی توان از روی تجمع میکروبی در سطوح سخت دندانی به تجمع و ارتباط آن در بافتهای مخاطی دهان پی برد)46،61،62) یکی از اهداف این مطالعه بررسی ارتباط میان گونه های میکروبی ، باکتری های استرپتوکک موتانس،سانگوئیس ،سوبرینوس و لاکتوباسیل در پلاک و مخاط در دو گروه secc و cf بوده است بر اساس نتایج بدست آمده ارتباط معنی داری میان میزان غلظت ژنوم s.mutan در پلاک و مخاط در گروه secc وجود دارد، اما این ارتباط در گروه cf یافت نشد.بدین معنی که با افزایش میزان استرپتوکک موتانس در پلاک دندانی کودکان مبتلا به پوسیدگی زودرس میزان این میکروارگانیسم در مخاط آنها نیز افزایش می یابد و بالعکس. لذا می توان نتیجه گرفت که بافت های نرم دهان به عنوان منبعی برای این میکروارگانیسم دخیل در پوسیدگی دندانی عمل می کند . لذا نیازمند توجه خاص به پروسه های بهداشت دهانی و درمانی در این نواحی می باشد(17). در مطالعه ما بر خلاف نتایج مطالعات گذشته مقادیر کمّی پایین تر میانگین غلظت ژنوم استرپتوکک سانگوئیس در نمونه های پلاک دندانی گروه cfدر مقایسه با گروه seccملاحظه گردید، اما این اختلاف بین دو گروه معنی دار نیست.در حالی که میزان این میکرو ارگانیسم درسطوح مخاطی دهان افراد cf در مقایسه با گروه secc بالاتر بوده است ،اما باز هم این اختلاف بین دو گروه معنی دارنبوده است.لذا اختلاف مشخصی دردو گروه شاهد و مورد ازجهت حضور استرپتوکوک سانگوئیس در مطالعه حاضر مشاهده نشد. mager و همکاران با روش dna-dna hybridizatiohn نمونه گیری از بافت های نرم دهان و پلاک را در افراد بالغ انجام دادند. نمونه های میکروبی سطوح بافت های نرم دهانی و پلاک به طور مشخصی در مناطق مختلف متفاوت بود. الگوی کلونیزاسیون استرپتوکک ها هم متغیر بود. میزان استرپتوکک سانگوئیس در مطالعه نمونه های پلاک فوق لثه ای بیش از نمونه های زیر لثه ای بوده است و بالاترین میزان را در نمونه های بافت نرم از سطح زبان و مخاط وستیبول و لب داشته است. در مطالعه حاضر میزان استرپتوکوک سانگوئیس چه در مخاط و چه در پلاک تفاوت معنی داری در دو گروه مورد و شاهد نشان نداد در حالی که درمورد استرپتوکوک موتانس این اختلاف کاملا معنی دار بوده است. شاید این امر بواسطه توانایی کلونیزیشن بالاتر استرپتوکوک موتانس در در سطح سخت دندان و توانایی استرپتوکک سانگوئیس درکلونیزه شدن هم بر روی بافت نرم و هم سطوح سخت باشد. بهرحال بافت نرم می تواند مخزن مناسبی برای پاتوژن های دندانی باشد و لذا مداخله درمانی در بافت نرم و بزاق در روند کنترل بیمای های دندانی ارزشمند خواهد بود(17). mager عنوان می دارد فلورمیکربی درسطوح دندانی مقداری تشابه نشان می دهد اما کاملا با بزاق و بافت نرم دهان متفاوت است(17).بطور کلی میزان تجمع استرپتوکوک موتانس نسبت به سالیواریوس و سا نگوئیس در نسج نرم کمتر است . استرپتوکوک سانگوئیس می تواند بروی نسج سخت ونرم با باند شدن به گلیکوپروتیین های بزاقی وصل شود(17). در مطالعه ge.y تمام کودکان secc , 100 درصد به استرپتوکک موتانس و 90 درصد به استرپتوکک سانگوئیس آلوده بودند .این شدت پوسیدگی کودکان با میزان استرپتوکک موتانس رابطه معنی داری نشان داد.همچنین شدت پوسیدگی با میزان کلی استرپتوکوکوس دهانی و تمام باکتری های قابل کشت حفره دهان و سن کودک رابطه معنی داری را نشان داد.معادلات رگرسیون نشان میدهد که تقابل بین استرپتوکک سانگوئیس و موتانس بطور معنی داری با وضعیت پوسیدگی مطرح بوده و به نظرمی رسد میزان نسبی این دو میکروارگانیسم در حفره دهان نقش مهمی در تکامل پوسیدگی ایفا میکند به نحوی که استرپتوکک سانگوئیس نقش آنتاگونیست بر علیه کلونیزاسیون استرپتوکک موتانس بازی میکند(40 ).این مطالعه به روش کشت سلولی انجام گرفته است .در شرایطی که مطالعه حاضر بر مبنای rt-pcr بوده و لذا ارتباط کمّی بسیار دقیق تر سنجیده شد و این ارتباط مشاهده نشد. در مطالعه حاضر رابطه میان غلظت ژنوم استرپتوکک موتانس پلاک و سانگوئیس پلاک (r: -0.332)و غلظت ژنوم استرپتوکک سانگوئیس و موتانس در مخاط(r: -0.263) و غلظت ژنوم سانگوئیس و لاکتوباسیل در مخاط(r:-0.033) در گروه cf همبستگی منفی نشان داده است.اگرچه این رابطه معنی دار نبوده بهر حال احتمال دارد نشان دهنده رابطه آنتاگونیستی دو میکرو ارگانیسم در گروه cf باشد.در حالی که در گروهsecc این رابطه منفی تنها بین لاکتوباسیل پلاک و استرپتوکک سانگوئیس پلاک مشاهده می شود(r:-0.131) وغلظت ژنوم استرپتوکک موتانس نه در مخاط و نه پلاک دندانی رابطه منفی با استرپتوکک سانگوئیس ندارد درحالیکه در گروه seccرابطه میان غلظت ژنوم موتانس در مخاط و پلاک (r:0.755,p-value:0.0001) بسیار قوی ورابطه میان غلظت ژنوم سانگوئیس در پلاک ومخاط (r:0.492,p-value:o.o28)نیز معنی دار بوده است. لذا مسئله تقابل موتانس و سانگوئیس در اینجا قابل بحث نیست.احتمال دارد در صورت نمونه گیری از نواحی پوسیده نتایج تفاوتهایی را نشان دهد. امروزه عقیده بر این است که لاکتوباسیل ها عامل آغازگر پوسیدگی نمی باشند,بلکه افزایش تعداد آنها در حفرات پوسیدگی به علت به وجود آمدن محیط اسیدی و نیز محل های مناسب جهت گیر باکتری است. علی رغم مطالعات بسیارگسترده در زمینه باکتری های آغاز کننده پوسیدگی و ضایعات اولیه مطالعات در زمینه شناسایی میکرو ارگانیسم های دخیل در زمینه پوسیدگی های عاج بسیار پراکنده و ناقص می باشد.لاکتوباسیل میکرو ارگانیسم دخیل هم در پاتوژنز پوسیدگی های عمیق و نیزپوسیدگی های سطحی تر می باشد(63). بر اساس نتایج مطالعه jorna.a که به روش pcr صورت گرفته است گونه های خاص مرتبط با بیماری پریو و پوسیدگی شناسایی نشدند. فلورباکتریال غالب در حفره سالم دهانی دارای تنوع زیادی در نواحی مختلف است و لذا شناسایی آن قبل از درک نقش باکتری در حفره دهان حائز اهمیت می باشد. به علاوه فلور باکتریایی درگیر در پوسیدگی های دندانی در حفرات سطحی و حفرات عاجی عمیق شامل هر دو گونه استرپتوکک موتانس و لاکتوباسیل بوده است(35). در تحقیق حاضر نیز مقادیر کمّی پایین تر لاکتوباسیل در نمونه های پلاک دندانی در گروه cfدر مقایسه با گروه seccملاحظه گردید اما اختلاف معنی دار نبود. در حالی که میانگین غلظت ژنوم این باکتری در سطوح مخاطی کودکان cf در مقایسه با گروه secc بالاتر بوده است که میتواند نشان دهنده تفاوت در توزیع کلونی های میکروارگانیسم های دهانی در سطوح مختلف دهان می باشد ولی علی رغم بالا بودن مقادیر در گروه مورد ,باز هم اختلاف بین دو گروه معنی دار نبوده است.درمجموع در مطالعه حاضر اختلاف مشخصی از جهت حضور لاکتوباسیل در دو گروه مشاهده نشد. مطالعه حیوانی michalek حضور لاکتوباسیل در زبان و مخاط دهان موش های ژنوبیوتیک را نشان داده است( 64). در مطالعه ahrne نیز با استفاده از بیولوژی مولکولی حضور لاکتوباسیل در مخاط دهان افراد بالغ cf تائید شده است که تائیدی بر حضور این میکروارگانیسم در مخاط دهانی به عنوان منبعی برای آن در محیط دهان است(65). تشخیص استرپتوکک ها و لاکتوباسیل در کودکان در مطالعات در سنین پایین مشخصا با تکامل و پیشرفت پوسیدگی مرتبط است لذا پیشگیری از سنین پایین اهمیت می یابد.این حقیقت که بافت نرم ,بزاق و زبان در مطالعات تجمع بیشتر باکتری های کاریوژن را از دندان ها نشان داده اند به این معنی است که این سطوح نیز باید از اهداف اولیه رعایت بهداشت و پیشگیری قرار گیرند.در واقع باکتری های کاریوژن در تقریبا تمام کودکان سالم رویت می شود و افزایش آن با بالا رفتن سن کودک دیده شده است(19). درمطالعه sotria gizani با روش dna-dna hybridization هدف بررسی توزیع باکتری کاریوژنیک در پنج ناحیه در حفره دهان بوده است. باکتری های کاریوژن در تمام بچه های سالم مشاهده شد. توزیع استرپتوکک موتانس در بافت های نرم، استرپتوکک سانگوئیس در ناحیه زیر لثه، بافت نرم و بزاق نشان داده شد. افزایش این میکروارگانیسم ها با بالا رفتن سن مشاهده شد در حالیکه خلاف آن در مورد لاکتوباسیل دیده شد(42). استرپتوکوک سوبرینوس در مطالعات مختلف مورد بررسی قرار گرفته است و مشخص گردیده همزیستی این باکتری با استرپتوکوک موتانس در تکامل پوسیدگی فاکتور مهمی تلقی می شود. مطالعات حیوانی نشان داد که استرپتوکوک سوبرینوس در حیوانات پتانسیل کاریوژنیک بالائی دارد. اما مطالعه seki نشان داد در کودکان 5/2-1 ساله سوبرینوس نقش بی اهمیتی در بروز پوسیدگی ایفا می کند(59). seki و همکاران با استفاده از روش pcr شیوع موتانس و سوبرینوس را به صورت مختلط و به صورت انفرادی بررسی کردند. نتایج نشان داد آن دسته از کودکان که dmfs بالاتری داشتند آلودگی بیشتری به صورت مختلط داشتند(سروتیپ های متعدد) و آنهایی که آلودگی با موتانس و سوبرینوس داشتند پوسیدگی بیشتری را نسبت به گروهی که فقط با موتانس و یا فقط با سوبرینوس داشتند، نشان دادند(59). بر اساس مطالعه choi استرپتوکوک سوبرینوس در قیاس با استرپتوکوک موتانس رابطه قویتری با پوسیدگی نشان میدهد. پوسیدگی در بچه هایی با داشتن استرپتوکوکهای موتانس وسوبرینوس 4 برابر بیش از کودکان صرفاً دارای استرپتوکوک موتانس پوسیدگی مشاهده شد و این مسئله میتواند مرتبط با اسیدوژنیسیتی بیشتر سوبرینوس از موتانس باشد(12). استرپتوکوک های موتانس و سوبرینوس از میکروب های اولیه پوسیدگی زا در انسان هستند(57qiong .(وهمکاران نشان دادند سوبرینوس کلونیزیشن خود را در حفره دهان بعد از استرپتوکوک موتانس انجام می دهد (47). در مطالعه حاضر کلیه مراحل آزمایشگاهی کشت ,pcr ,real- time pcr مربوط به شناسایی استرپتوکک سوبرینوس همانند سایر باکتری ها در نمونه های پلاک دندانی و مخاط دهان انجام گرفته است. با توجه به این که توالی ژنوم استرپتوکک سوبرینوس تا زمان انجام این مطالعه در بانک ژنی ثبت نشده بود و در هیچ یک از مطالعات انجام شده نیز سایز ژنوم این باکتری ذکر نشده بود، جهت تهیه استاندارد مورد نیاز در real time pcr از تکثیر قطعه ای از ژنوم باکتری با روش pcr و سپس تخلیص آن با استفاده از کیت استخراج از ژل استفاده شد ولی علیرغم تهیه استاندارد مناسب، با توجه به نتایج بدست آمده از آزمایشreal- time pcr در آنالیز منحنی ذوب مربوط به نمونه های dnaاسترپتوکک سوبرینوس پلاک دندانی و سلول های مخاطی انسان، نقطه ذوب قطعات تکثیر شده در نمونه ها همانند نمونه های استاندارد در درجه حرارت یکسان قابل بررسی نمی باشد که می تواند به دلیل شناسایی غیر اختصاصی قطعه ای دیگر در ژنوم باکتری توسط پرایمر های مربوط به این باکتری باشد جهت انجام این بخش از کار و حصول به نتیجه دلخواه، نیاز به طراحی مجدد چندین جفت پرایمر وانجام مجدد تمامی مراحل کار جهت بهینه سازی روش و دستیابی به اطلاعات صحیح قابل مقایسه در مطالعه می باشد اما باتوجه به محدودیت زمانی امکان انجام آن در این تحقیق میسر نبوده است. درمطالعه حاضربه بررسی 3 نوع سوش میکروبی به صورت تجمعی در نسج نرم و سخت دندانی پرداخته شده درحالی که در مطالعات قبلی بطور همزمان بر روی چند میکروارگانیسم این ارزیابی کمّی صورت نگرفته است .درمطالعات قبلی بیشتر متد های مورد استفاده کشت میکروبی و pcr بوده و ارزیابی با روش real time pcr کمتر ازسایر روش ها رایج بوده است که این موضوع بیشتر به دلیل هزینه بری بالاتر، زمان بر بودن بهینه سازی روش و تخصصی بودن انجام این تست در مقایسه با روش های معمول آزمایشگاهی است. مطالعه حاضر بر روی کودکانی انجام شد که از لحاظ بهداشت و نوع تغذیه مشابه بودند و طیف سنی محدودتری انتخاب گردید حال آنکه اکثر مطالعات در دامنه سنی دندانهای شیری، مختلط و دائمی بررسی را انجام داده اند. با توجه به شرایط فوق مداخل? عوامل مخدوش کننده تا حد زیادی کاهش یافته و لذا از این جهت نتایج می تواند از دقت بالاتری بهره مند باشد وجه تمایز دیگر این مطالعه از مطالعات دیگر استفاده از لوپ و سواب های مخصوص نمونه گیری به منظور استاندارد و یکسان سازی میزان برداشت پلاک دندانی و سلول های مخاطی دهان از افراد مختلف وافزایش دقت کار بوده که لازمه انجام یک مطالعه کمّی است. برای برداشت پلاک دندانی از لوپ استریل یک بار مصرف (disposable loops cat –no:731101,greiner bio-one usa) استفاده شد.ظرفیت دهانه این قلم جهت برداشت پلاک lµl می باشد که جهت استاندارد سازی میزان پلاک برداشت شده استفاده میشود.از تمامی کودکان 4 میکرو لیتر پلاک برداشته شد یعنی برای هر کودک چهار عدد لوپ یک بار مصرف در حین نمونه گیری استفاده شد. نمونه گیری از سطح پشتی زبان(در ناحیه زبان یک مربع 1×1 سانتی متر برای مدت 5 ثانیه برس زده میشود) ومخاط باکال،قسمت قدامی وستیبول و مخاط گونه مندیبل و ماگزیلا با استفاده از سواب و برس مخصوص (masteramptm buccal (swab brushmadisn wi53713 usa صورت گرفت. از مزایای دیگر این تحقیق یکسان سازی نمونه ها در مخاط با استفاده از ژن بتا گلوبین بوده است که در سایر مطالعات بکار نرفته است. باتوجه به این که برداشت سلول های مخاطی با کاربرد سواب و برس است امکان خطا در میزان سلول های برداشته شده به دلیل تفاوت در سطح برداشت نمونه و نیز تفاوت در فشار دست در حین نمونه گیری وجود دارد. به منظور یکسان سازی تمام سلول های مخاطی، ژن بتاگلوبین که یک house kipping ژن در تمام سلول های انسانی است به عنوان internal control در نظر گرفته شده و تمام مراحل pcr و real time pcr برای آن صورت گرفته ودر نهایت میزان غلظت ژنوم باکتری های مورد مطالعه در سلول های مخاطی بعد از یکسان سازی بر اساس ژن بتاگلوبین با استفاده از محاسبات ریاضی اندازه گیری شده است. در تحقیق حاضر مشابه با مطالعه choiو همکاران انتخاب نمونه پلاک از نواحی سالم دندان ها صورت گرفته تا مشابه سازی شرایط نمونه برداری وجود داشته باشد.و لذا شاید نتایج با نواحی پوسیده متفاوت باشد.درروش realtime pcr نمونه گیری بسیار حساس است و می تواند نتایج را تحت تاثیر قرار دهد(12). لذا درمطالعه حاضر این امر جهت یکسان سازی نمونه گیری رعایت شده است. لذا در صورتی که بتوان نواحی پوسیده دندانی را در نمونه ها یکسان سازی نمود و برداشت نمونه پلاک را از نواحی عمیق پوسیدگی انجام داد احتمال دارد نتایج دستخوش تغییرگردد. این مطالعه بصورت مقطعی صورت گرفته و در درازمدت احتمال تغییر شرایط در دهان این افراد می باشد، لذا مطالعات طولانی مدت نیز می تواند مکمل مفیدی در ادام? این تحقیق محسوب شود تا با بررسی تغییر شرایط تأثیر گذار مشخص شود که آیا تجمع و همچنین حضور مخلوط این میکرو ارگانیسم هادستخوش تغییر می شود یا خیر و در ادامه ریسک فاکتورهای ایجاد کننده پوسیدگی ها بهتر روشن خواهد شد. طبق نتایج مطالعه حاضر فقط تعداد استرپتوکوک موتانس در مخا ط و پلاک به تنهایی و هم چنین مجموع پلاک و مخاط درگروهsecc بصورت معنی داری از گروه cf بالا تر بوده است.صرفا همبستگی بین استرپتوکوک موتانس در مخاط و پلاک در گروهsecc مطرح بوده است و در هیچ مورد دیگر همبستگی میکروارگانیسم ها دربافت سخت و نرم مشاهده نشد.